Застосування ультрафільтрації у виробництві вакцини проти сказу людини
Щоб сприяти застосуванню ультрафільтрації у виробництві вакцини проти сказу людини, для концентрування розчину збору вірусу сказу та виявлення відновлення антигену, швидкості видалення ендотоксину та швидкості видалення білка хазяїна після ультрафільтрації використовувалася ультрафільтраційна мембранна касета 300 кДа. Результати показали, що під відповідним тиском розчин збору вірусу сказу було сконцентровано у 80 разів, елюйовано 25 разів, швидкість відновлення антигену становила 86.2%, швидкість видалення бактеріального ендотоксину становила 87,5% ~ 88,7%, і швидкість видалення білка хазяїна становила 91,6%.
Передмова
Сказ — це традиційне давнє зоонозне захворювання, спричинене вірусом сказу (RV), з летальністю до 100%. На даний момент не існує ефективного лікування постконтактних захворювань (тобто пошкодження шкіри та слизових оболонок), окрім екстреної вакцинації та щеплення імуноглобуліном. Основним джерелом сказу у людини є укуси хворих або потенційно інфікованих тварин (переважно собак). Смертність від сказу в Китаї посідає друге місце в світі, і сказ є однією з проблем, що загрожують безпеці охорони здоров'я в нашій країні. Капсульний глікопротеїн вірусу сказу, який є єдиним ключовим антигеном, що індукує вироблення захисних нейтралізуючих антитіл, був у центрі дослідження та розробки нових вакцин і нових технологій діагностики та лікування вірусу сказу.
Вірус сказу належить до роду вірусів сказу родини рабдовірусів. Форма нуклеокапсиду еластична, нуклеокапсид спірально симетричний, поверхня має оболонку, що містить одноланцюгову РНК. Це збудник, який викликає сказ. Вірус сказу має два основних антигени: один – це глікопротеїновий антиген на зовнішній мембрані вірусу, який може зв’язуватися з рецептором ацетилхоліну, щоб зробити вірус нейротоксичним, і виробляти нейтралізуючі антитіла та антитіла, що пригнічують гемаглютинацію в організмі, і нейтралізуючі антитіла мають захисний ефект; Інший — це внутрішній рибопротеїновий антиген, який може змусити організм виробляти антитіла, що зв’язують комплемент, і преципітин, і не має захисного ефекту.
Ендотоксин — це різновид ліпополісахариду (ЛПС), який має термостійкість і хімічну стабільність і його непросто знищити. Якщо у вакцині буде певна концентрація ендотоксину, це спричинить сильну лихоманку і навіть смерть після щеплення, тому вміст ендотоксину у вакцині слід максимально знизити. Видання Китайської фармакопеї 2005 року (частина III) визначило, що контрольне значення кваліфікованого індексу ендотоксину вакцини проти сказу не повинно перевищувати 100ЄО/дозу. Зі швидким розвитком технології мембранного поділу застосування технології ультрафільтраційного мембранного поділу для зниження вмісту ендотоксину у вакцинах стає все більш поширеним у фармацевтичній промисловості.
Вакцина проти сказу — це вакцина проти сказу. Зазвичай існує три типи вакцин проти сказу, включаючи очищену клітинну вакцину Vero, людську диплоїдну клітинну вакцину та вакцину з первинної клітинної культури. Вакцину проти сказу виготовляють шляхом інокуляції фіксованого вірусу сказу в клітинну матрицю після культивування, збору, концентрації, інактивації, очищення та додавання відповідного стабілізатора. Основною функцією вакцини проти сказу є стимулювання організму до швидкої імунної відповіді та вироблення захисних антитіл проти вірусу сказу, щоб запобігти інфекції, викликаній вірусом, і знизити ризик захворювання.
Процес виробництва вакцини відіграє важливу роль у забезпеченні якості вакцини, особливо кількісне визначення деяких показників у процесі виробництва є більш важливим. У процесі виробництва вакцини проти сказу людини технологія ультрафільтраційного концентрування є необхідним засобом виробництва вакцини проти сказу людини. Використання ультрафільтраційної мембрани з розумною апертурою для ультрафільтраційної концентрації може ефективно видалити ендотоксин і білок господаря, а також зберегти антиген RV, що сприяє виробництву вакцини та покращенню якості. Відносна молекулярна маса молекул RV становить 350 кДа ~ 460 кДа, і теоретично RV може бути повністю захоплений концентрацією ультрафільтрації за допомогою мембранної касети з молекулярною масою перехоплення 100 кДа та 300 кДа. Ендотоксин часто утворює агрегатну структуру в різних водних розчинах, через ступінь агрегації розмір молекули різний. Відносна молекулярна маса мономеру ендотоксину становить 10 кДа ~ 20 кДа, а відносна молекулярна маса його форми полімеризації становить 300 кДа ~ 1000 кДа або більше 1000 кДа. Виходячи з різниці в молекулярній масі, антиген RV у вакцині проти сказу людини був збережений, а ендотоксин і білок хазяїна у вакцині проти сказу людини були видалені ультрафільтраційною мембраною 300 кДа.
У цьому експерименті ультрафільтраційна мембранна касета з отвором 300 кДа та площею мембрани 0,11 м2 використовувалася як обробка невеликих зразків для концентрування проміжних продуктів вакцини проти сказу людини, а також мембранний потік, ефективність обробки, множинна концентрація, перехоплення антигену, видалення ендотоксину , і видалення білка хазяїна були перевірені.
2Матеріальний метод
2.1 Експериментальні матеріали
Вірус сказу фіксований вірус CTN-IV штам; клітини Vero; 0.5M гідроксид натрію; Ультрафільтраційна мембранна касета 300 кДа (матеріал PES, площа мембрани 0,11 м²).
2.2 Експериментальні методи
2.2.1 Приготування розчину для збирання вірусів
Заморожені клітини Vero реанімували в теплій воді при температурі 37 ~ 39 градусів, суспензію клітин відсмоктували, а потім додавали до культурального середовища 199, що містить 10% інактивованої телячої сироватки. Клітини однорідного моношару культивували при 37 градусах. Штам CTN-IV інокулювався вірусом сказу у співвідношенні 0.1моль/л і культивувався при 37 градусах. Через 48 годин культуральне середовище було викинуто та додано культуральне середовище 199, що містить 0,1% альбуміну крові людини, щоб підтримувати культуру при 33 ~ 35 градусах. Збирайте отруту хвороби один раз кожні 3d-5d і об’єднуйте кілька отриманих рідин.
2.2.2 Встановлення мембранної касети
Встановіть мембранну касету та підключіть проводку, як показано на малюнку нижче.
2.2.3 Промивання водою
Закрийте впускний клапан, зворотний клапан і прохідний клапан і вставте зворотний кінець і наскрізну кінцеву трубу в бак для відпрацьованої рідини. Заповніть приймальний резервуар 1 л води для ін’єкцій.
Відкрийте впускний і зворотний клапани, закрийте прохідні клапани, відкрийте насос, очистіть зворотну лінію 10% об’єму очищеної води або води для ін’єкцій і підтримуйте вхідний тиск на рівні 0,35 бар (5 фунтів на квадратний дюйм).
Відкрийте клапан фільтра, закрийте зворотний клапан і використовуйте воду, що залишилася для впорскування, для очищення труби фільтра, підтримуючи TMP на рівні 0,35 бар.
2.2.4 Дезінфекція
Закрийте впускний клапан, зворотний клапан і трансмісійний клапан і вставте зворотний кінець і кінцеві лінії трансмісії в резервуар для відпрацьованої рідини. Заповніть приймальний бак 2 л миючого розчину.
Відкрийте вхідний і зворотний клапани, закрийте прохідні клапани, відкрийте насос, очистіть зворотну лінію 200мл 0,5 М гідроксиду натрію та підтримуйте вхідний тиск на рівні 0,35 бар (5 фунтів на квадратний дюйм) .
Відкрийте прохідний клапан, закрийте зворотний клапан і очистіть прохідну трубу об’ємом 200 мл миючого розчину, підтримуючи TMP на рівні 0,35 бар.
Потім зворотний кінець і наскрізний кінець труби вставляються в резервуар для рідини для циклічного очищення. Цикл очищення з тангенціальною швидкістю потоку, яка в 1 ~ 1,5 рази перевищує процес, протягом 30 хв.
Злийте 0.5 М гідроксиду натрію та промийте водою для ін’єкцій відповідно до 2.2.4 до нейтральної реакції.
2.2.5 Випробування потоком води
У забірну ємність додайте очищену воду, виміряйте та запишіть температуру води в забірній ємності. Вставте зворотний кінець в резервуар. Запустіть насос і відрегулюйте швидкість насоса та зворотний клапан, щоб досягти різниці міжмембранного тиску 0.35 бар (5 фунтів на квадратний дюйм). За допомогою циліндра виміряйте та запишіть швидкість потоку на прохідному кінці в мл/хв. Відрегулюйте швидкість насоса та зворотний клапан, щоб отримати трансмембранний перепад тиску 1 бар (15 фунтів на квадратний дюйм). За допомогою циліндра виміряйте та запишіть швидкість потоку на прохідному кінці в мл/хв.
Щоб стандартизувати значення потоку води, розділіть розраховане значення потоку води на різницю трансмембранного тиску та помножте коефіцієнт температурної корекції в наступній таблиці.
2.2.6 Концентрація ультрафільтрації
Промийте воду із системи буферною кришкою. Цикл протягом 5 хвилин, щоб відрегулювати рН та іонну стабільність системи. Якщо температуру потрібно відрегулювати, продовжуйте цикл, доки температура системи не стане стабільною.
Додайте живильну рідину у приймальний резервуар, встановіть швидкість потоку корму (наприклад, 400LMH) і перевірте швидкість потоку при різних значеннях TMP. Згідно з даними тестування, криві були накреслені з TMP як абсциса та Flux як ордината.
Направте наскрізну трубу у відповідний контейнер або дренаж, такий як наскрізні збірні резервуари, резервуари для відпрацьованої рідини та технологічні стоки.
Запишіть початкову вагу живильної рідини в живильному резервуарі, запустіть живильний насос і повільно циркулюйте живильну рідину протягом 3-4 хвилин. Рециркуляція може допомогти видалити залишки повітря на шляху потоку, таким чином максимізуючи ефективність плівки.
Відкрийте прохідний клапан, повільно збільшуйте швидкість насоса, поки не буде досягнуто оптимальної тангенціальної швидкості потоку, і відрегулюйте зворотний клапан для досягнення оптимального TMP системи.
Потім помістіть трубку в контейнер для збору, почніть відраховувати час, коли рідина потрапляє в контейнер, і записуйте вхідний і зворотний тиск через відповідні проміжки часу, а також записуйте якість рідини протягом часу на зворотному кінці та наскрізному кінці, щоб обчислити миттєвий швидкість потоку.
Ультрафільтраційне концентрування зразка завершується, коли об’єм рідини в подачі зменшується до об’єму цільової концентрації.
2.2.7 Діаліз
Помістіть впускну трубу, трубу поповнення та зворотну трубу у приймальний резервуар, помістіть трубу передачі в збірний контейнер і поставте збірний контейнер на ваги, щоб очистити.
Відкрийте зворотний клапан, запустіть впускний насос, відкрийте прохідний клапан, відрегулюйте швидкість насоса та TMP до відповідного значення. Відкрийте насос поповнення, зберігайте об’єм рідини у впускному резервуарі незмінним і розпочніть діаліз рівного об’єму. Почніть вимірювати час, коли рідина потрапляє в контейнер, і зафіксуйте тиск на вході, зворотному кінці та масу рідини у відповідний проміжок часу, а потім обчисліть миттєву швидкість потоку.
2.2.8 CIP
Спочатку промийте буфером, потім промийте водою для ін’єкцій (операція 2.2.3), потім очистіть миючим засобом (операція 2.2.4) і, нарешті, промийте водою для ін’єкцій (операція 2.2.3).
2.2.9 Випробування потоком води
Операція виглядає наступним чином: 2.4.5.
2.2.10 Консервація мембранної касети
Короткочасне зберігання (менше або дорівнює 3 дням), тримайте мембранну касету в пристосуванні та використовуйте розчин для зберігання, щоб циклювати від 10 до 15 хвилин, закрийте системний клапан, відключіть живлення рідинного насоса та переконайтеся, що що вхідний резервуар для рідини належним чином герметичний.
Якщо термін зберігання становить від 3 днів до 1 місяця, вийміть мембранну касету з приладу та запечатайте її в поліетиленовий пакет або інший герметичний контейнер. Додайте приблизно від 50 мл до 100 мл розчину для зберігання в пластиковий пакет або герметичний контейнер і закрийте його. Або його можна занурити безпосередньо в розчин для зберігання. У наступній таблиці рекомендовані умови зберігання.
3 Результати та аналіз
3.1 Дослідження факторів впливу на ефективність видалення пірогенів
Робочий тиск ультрафільтрації: 15 тестових партій проводили безперервно. У кожній партії тиск фільтрації підтримували на рівні 5, 10, 15 і 2{{10}}psi під час ультрафільтрації, а рідину для збору вірусу концентрували в 30 разів і елюювали буферною рідиною (10-кратний об'єм) безперервним потоком. Результати, як показано в таблиці нижче, швидкість видалення ендотоксину становила менше 87,0%, швидкість відновлення антигену була стабільною на рівні 86,0%, а швидкість видалення білка хазяїна була стабільною на рівні 90,0%, що свідчить про те, що що різні робочі тиски мало впливають на ефект відновлення антигену, видалення ендотоксину та видалення білка господаря.
Коефіцієнт концентрації ультрафільтрації: 15 тестових партій проводили безперервно. У кожній партії рідину для збору вірусу концентрували в 30 разів, 50 разів, 80 разів і 100 разів відповідно під час ультрафільтрації. Тиск фільтрації підтримували на рівні 20 psi, і буферну рідину (10-кратний об'єм) елюювали безперервним потоком. Результати, як показано в наведеній нижче таблиці, швидкість видалення ендотоксину коливалася від 53,3% до 86,9%, швидкість відновлення антигену залишалася стабільною на рівні 86,0%, а швидкість видалення білка хазяїна був стабільним на рівні 91,0%. При сегментованому відборі антигену в розчині для передачі не було виявлено, і в концентрованому розчині вірусу залишилося менше 10% білка хазяїна. Концентрація ендотоксину в концентрованому розчині вірусу зростала зі збільшенням концентрації в рази, а швидкість видалення ендотоксину була найвищою в концентрованому зразку у 80 разів, і виробник також міг розглянути концентрацію в 100 разів, що не тільки покращив ефективність виробництва та знизив вартість, але також відповідав вимогам виробництва вакцин.
3.2 Вичерпання потоку мембранної касети та регенерація очищення
Після лікування швидкість відновлення мембранного потоку становила 92,6%. Перша швидкість відновлення нової мембранної касети є нормальною, відповідно до поточних спостережених властивостей живильної рідини, наступного прогнозу другого та NTH разів, швидкість відновлення потоку мембранної касети буде близькою до даних після цієї обробки, і мають тенденцію бути стабільними. Протягом 2 годин одноразового використання мембранна касета була ідеальною, і лише 10% мембранного потоку було виснажено під час загальної роботи.
3.2.1 Збіднення потоку в процесі обробки мембранної касети
3.2.2 Результат очищення та регенерації мембранної касети
Про Гідлінга
Guidling Technology — це національне високотехнологічне підприємство, яке спеціалізується на біофармацевтиці, культурі клітин, очищенні та концентрації біомедицини, діагностиці та промислових рідинах. Ми успішно розробили відцентрові фільтрувальні пристрої, ультрафільтраційні та мікрофільтраційні касети, вірусний фільтр, систему TFF, глибинний фільтр, порожнисте волокно тощо, які повністю відповідають сценаріям застосування біофармацевтичних препаратів, культур клітин тощо. Наші мембрани та мембранні фільтри широко використовуються в концентрації, екстракції та розділенні попередньої фільтрації, мікрофільтрації, ультрафільтрації та нанофільтрації. Наші численні лінійки продуктів, від невеликих одноразових лабораторних фільтрів до виробничих систем фільтрації, тестування на стерильність, ферментації, культур клітин тощо, відповідають потребам тестування та виробництва. Guidling Technology з нетерпінням чекає на співпрацю!