Повний аналіз процесу виробництва ліків МРНК: як технологія TFF вирішує проблеми очищення
В останні роки технологія мРНК досягла прориву в біофармацевтичній галузі, продемонструвавши величезний потенціал застосування, зокрема у вакцинах і генній терапії. Успішна розробка мРНК-вакцин не тільки забезпечила нові рішення для профілактики та боротьби з інфекційними захворюваннями, але також сприяла розвитку імунотерапії раку та персоналізованої медицини. Як новий клас терапевтичних продуктів, широкомасштабне-виробництво мРНК є надзвичайно складним завданням, включаючи контроль стабільності РНК, видалення залишкових ферментів і побічних-продуктів реакції, обмін буфера та досягнення високої-швидкості відновлення чистоти, усе це потребує виробничих технологій із-схваленими регуляторами рішеннями.
Процес виробництва мРНК-вакцин або терапевтичних засобів в основному поділяється на три етапи: приготування масового розчину плазмідної ДНК, приготування масового розчину мРНК і приготування лікарського продукту мРНК-LNP.
Блок-схема процесу виробництва ліків мРНК
Фільтрація тангенціального потоку (TFF), як-відома технологія розділення мембран, широко застосовується у виробництві мРНК завдяки її високо-ефективності молекулярного сита, контрольованому обміну буфера та низьким характеристикам напруги зсуву. Базуючись на конструкції мембранного модуля, поширені конфігурації TFF включають плоскі-листові касети та модулі з порожнистим-волокном. Крім того, мембранне розділення під тиском- у TFF можна класифікувати на мікрофільтрацію (MF), ультрафільтрацію (UF), нанофільтрацію (NF) і зворотний осмос (RO) відповідно до розміру пор мембрани з поступово зростаючою селективністю.
TFF відіграє вирішальну роль на багатьох етапах виробництва лікарських засобів мРНК, включаючи підготовку основної маси плазмідної ДНК, масове виробництво мРНК і остаточне складання лікарських засобів мРНК-LNP. Завдяки відповідному вибору типу мембрани, відсічення молекулярної{1}}маси (MWCO) і матеріалу мембрани TFF забезпечує ефективне видалення побічних-продуктів реакції та низько{3}}молекулярних-домішок, а також сприяє обміну буфера та концентрації як до, так і після інкапсуляції LNP. Це значно підвищує чистоту РНК, стабільність і загальну масштабованість процесу.
Крім того, на ефективність тангенціальної фільтрації потоку впливають такі фактори конфігурації системи, як тип насоса та конструкція труб, а також ключові параметри процесу, включаючи трансмембранний тиск (TMP), напругу зсуву та фільтраційний потік. Ці фактори мають бути ретельно відібрані та оптимізовані на основі характеристик цільового продукту, особливо для продуктів, -чутливих до стресу, таких як мРНК-LNP, які дуже чутливі до зовнішніх механічних сил під час обробки.
Очищення плазмідної ДНК
Приготування вихідного розчину плазмідної ДНК фундаментально базується на дизайні послідовності матриці транскрипції. Методи підготовки зазвичай включають ампліфікацію плазмідної ДНК, хоча також можна використовувати ампліфікацію ПЛР. Візьмемо як приклад ампліфікацію ДНКкишкова паличказазвичай використовується для-підсилення на основі бродіння. Наступний процес очищення в основному включає збір клітин, лізис та освітлення, концентрацію та обмін буфера, стерильну фільтрацію, лінеаризацію та хроматографічне очищення. У промислових умовах центрифугування безперервним -потоком часто використовується для збору клітин, але воно створює відносно високі сили зсуву. Системи з порожнистими волокнами з їх відкритими каналами та низьким зсувом більше підходять для обробки зразків із високим вмістом твердих речовин, високою в’язкістю або чутливістю до зсуву, наприклад плазмідної ДНК. Після збирання клітини піддаються гомогенізації під високим -тиском, ультразвуковій обробці або лужному лізису з наступним попереднім освітленням через глибинну фільтрацію.
Щоб полегшити наступну хроматографію, спочатку для концентрації та обміну буфера часто використовується тангенціальна фільтрація потоку (TFF) з використанням мембранних касет або колонок із порожнистим волокном із молекулярною масою, що відрізається-в 30 кДа, 100 кДа або 300 кДа. Це зменшує об’єм зразка з одночасним видаленням деяких домішок, таких як РНК, білки клітини-господаря (HCP) і фрагменти ДНК клітини-господаря (HCD). Хроматографія служить етапом очищення ядра. Як правило, аніонообмінна хроматографія (AEX) поєднується з хроматографією гідрофобної взаємодії (HIC) для ефективного видалення домішок і збагачення високобіологічно активної суперскрученої плазмідної ДНК, таким чином значно покращуючи чистоту плазміди.
Після очищення плазміду знову піддають TFF для концентрації розчину до цільової концентрації (зазвичай 0,5–2 мг/мл) і для проведення діалізу з буфером остаточного зберігання. Цей етап видаляє залишкові солі та органічні розчинники з процесу, забезпечуючи відповідність буферної системи вимогам для подальших реакцій транскрипції in vitro (IVT).
Очищення in vitro транскрибованої (IVT) мРНК
Транскрипція in vitro (IVT) і модифікація є ключовими процесами для приготування вихідних розчинів мРНК. Під час виробництва мРНК IVT використовується комбінація фільтрації тангенціального потоку (TFF1) – хроматографії – фільтрації тангенціального потоку (TFF2). Ця стратегія забезпечує ефективне та високо{4}}якісне очищення мРНК, надаючи важливу підтримку для виробництва вакцин.
Після завершення реакцій транскрипції та модифікації спочатку зазвичай виконується ультрафільтрація/діафільтрація з використанням мембранних касет або колонок із порожнистим волокном із молекулярною масою, яка-відрізається 30 кДа, 100 кДа або 300 кДа. Цей етап ефективно видаляє з реакційної системи різноманітні-пов’язані з процесом домішки, такі як РНК-полімераза, залишкові фрагменти ДНК, NTP, що не прореагували, блокуючі ферменти, дволанцюгову-РНК (dsRNA) та інгібітори малих-молекул, одночасно досягаючи обміну буфера. Після одного етапу фільтрації тангенціального потоку більшість домішок ефективно видаляється, і єдиною виявленою залишковою білковою домішкою є РНК-полімераза.
Згодом для подальшого очищення застосовують кілька методів хроматографії. До загальновживаних методів належать афінна хроматографія, хроматографія-виключення, іонно{2}}парна хроматографія з-оберненою фазою та іонообмінна хроматографія. Завдяки цій комбінації ультрафільтрації та послідовної хроматографії мРНК досягає високого рівня чистоти.
Щоб відповідати вимогам до рецептури або зберігання, вихідний розчин мРНК знову концентрують або розбавляють, використовуючи мембранні касети 30 кДа, 100 кДа або 300 кДа або колонки з порожнистими волокнами, щоб точно відрегулювати цільову концентрацію та замінити на буфер остаточного складу. Нарешті, стерильна фільтрація-застосовується для контролю мікробного навантаження, завершуючи тимчасове зберігання та заповнення матеріалу.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Очищення композицій мРНК-LNP
Ліпідні наночастинки (LNP) на даний момент є найбільш дослідженою системою доставки для терапії мРНК. Наразі різні препарати мРНК-LNP знаходяться на різних стадіях доклінічної та клінічної розробки. LNP дуже чутливі до виробничих процесів. Серед операцій, необхідних для виробництва мРНК-LNP, концентрація та обмін буфера за допомогою тангенціальної фільтрації (TFF), а також стерильної фільтрації становлять значні проблеми. Ці кроки необхідно ретельно оптимізувати, щоб забезпечити масштабованість процесу та якість продукту, уникаючи при цьому таких проблем, як забруднення мембрани та неправильне завантаження фільтра.
Після інкапсуляції мРНК для очищення використовується тангенціальна фільтрація (TFF). Метою цього етапу є видалення неінкапсульованої мРНК, вільних полімерів або ліпідних матеріалів, а також залишкових розчинників з мРНК і ліпідів. Оскільки мРНК-LNP демонструють обмежену стабільність при кімнатній температурі, оптимізація подальших процесів, включаючи TFF, має вирішальне значення для підтримки якості продукції.
Основні напрямки оптимізації включають: відповідне налаштування трансмембранного тиску (TMP) і тангенціальної швидкості потоку на основі розміру частинок і стабільності мРНК-LNP, щоб збалансувати ефективність фільтрації та напругу частинок; вибір мембран або колонок з порожнистими волокнами з відповідними обмеженнями молекулярної ваги (MWCO, наприклад, 100 кДа або 300 кДа) для ефективного видалення вільної мРНК, домішок і обмінного буфера при мінімізації адсорбції або пошкодження частинок; оптимізація об’ємів концентрації та діафільтрації для забезпечення ефективного обміну буфера в цільову композицію та контролю кінцевої концентрації та дисперсності частинок.
Крім того, критичні параметри якості (такі як розмір частинок, індекс полідисперсності [PDI] та ефективність інкапсуляції мРНК) необхідно ретельно контролювати під час процесу, а параметри динамічно коригувати на основі даних у реальному-часі для досягнення стабільного, масштабованого та ефективного очищення та формулювання мРНК-LNP.
Крім того, через нестабільність мРНК-LNP та їх компонентів під час кінцевих методів стерилізації для видалення бактерій та інших мікробних забруднень зазвичай використовується стерильний фільтр 0,2 мкм-.