Технологія інактивації та видалення вірусів препаратів крові

Продукти крові — це «компоненти білка плазми крові або компоненти клітин крові, такі як альбумін крові людини, імуноглобулін людини, концентрат еритроцитів фактора згортання крові людини (природний або рекомбінантний) тощо, відокремлені від плазми здорової людини або плазми людини зі специфічним імунітетом, очищена або виготовлені за технологією рекомбінантної ДНК для діагностики, терапії або пасивної імунопрофілактики». Продукти крові відіграють важливу роль у невідкладній медичній допомозі, порятунку поранених у війні, а також у профілактиці та лікуванні деяких специфічних захворювань.

 

Нормативна основа

Практики забезпечення безпеки повинні гарантувати, що кінцевий препарат є безпечним для регуляторів і, зрештою, для пацієнтів і громадськості. У 1990-х роках Міжнародна координаційна конференція (ICH 1998) видала «Q5A: Оцінка вірусної безпеки біотехнологічних продуктів людського або тваринного походження клітинних ліній» (Q5A: Viral Safety Assessment), встановивши всесвітній стандарт вірусної безпеки.

ICH Q5A описує багаторівневу схему тестування та проходження перевірки для досягнення цієї мети. Програма випробувань зосереджена на зборі клітинних банків, сировини та біореакторів, доповнених аналізом ризиків продукту. На додаток до тестування ICH Q5A вимагає, щоб дезактивація нижче за течією була оцінена як безвідмовний захід, якщо не виявлено забруднювачів вище за течією. Перевірка дозволу гарантує, що якщо будь-який вірус ухиляється від режиму тестування, його можна видалити та/або інактивувати перед тим, як потрапити в кінцевий лікарський продукт.

 

Передумови загальної програми захисту від вірусів

У сучасному біотехнологічному виробництві (або біообробці) зазвичай є три або чотири одиничні операції у всій послідовності очищення, здатні видалити або інактивувати вірус. Це включає в себе певні хроматографічні етапи (такі як протеїн А або аніонний обмін), культивування з низьким рН або детергенти та фільтри для утримання вірусів. Не всі ці кроки ефективно видалять або дезактивують усі віруси.

Наприклад, культура з низьким pH зазвичай неефективна для інактивації вірусу без оболонки, але вона добре працює для інактивації вірусу з оболонкою. За певних робочих умов аніонообмінна колонка може бути не в змозі зв’язати та видалити нейтральні ізоелектричні віруси з потоку продукту, але вона ефективна проти кислих вірусів.

Це комбінація трьох-чотирьох незалежних і ортогональних одиничних операцій, які разом забезпечують вірусну безпеку біотехнологічних продуктів.

 

Зазвичай передбачається, що надійний, ефективний і надійний етап обробки зможе видалити або дезактивувати велику кількість вірусів (зазвичай визначається як 4 log10 або більше, де значення журналу зменшення або LRV розраховується як log10 загальної кількості вірусів). кількість вірусів на вході поділена на загальну кількість вірусів на виході). Однак LRV не можна використовувати як єдиний абсолютний показник ефективності кроку. Дані можуть бути попередніми. Його легко моделювати, відносно нечутливий до змін умов процесу та ефективний проти ряду вірусів (ВООЗ 2004).

Вірусна фільтрація широко визнана таким потужним і ефективним етапом процесу та є ключовим компонентом загальної стратегії мінімізації ризику екзогенних та ендогенних вірусних частинок під час виробництва біотехнологічних продуктів.

Вірусні фільтри часто працюють через потужні механізми утримання, засновані на розмірі. Завдяки цьому потужному механізму дії вірусні фільтри з більшою ймовірністю, ніж хроматографічні етапи, забезпечать передбачуване утримання вірусів для ряду вірусів. Це пов’язано з тим, що на фільтр менше ймовірно впливають відмінності у фізико-хімічних властивостях різних вірусів і взаємодія вірус-смола, що регулюється умовами експлуатації. Тому стадія вірусної фільтрації зазвичай використовується в добре розроблених рекомбінантних терапевтичних процесах очищення білка (EMEA 1996), які також показали надійну продуктивність у промисловості обробки плазми.

 

Однак препарати крові – це як палиця з двома кінцями, яка не тільки рятує тисячі життів, але й може поширювати хвороби та становити загрозу здоров’ю людей. Згідно зі статистичними даними, з 1977 по 1984 рік щонайменше 30 000 реципієнтів крові в США отримали кров, заражену вірусом СНІДу. У 1985 році 1200 із 3000 хворих на гемофілію у Франції були інфіковані СНІДом через переливання крові або препаратів крові.

За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я, від 5% до 10% заражень СНІДом у всьому світі спричинені переливанням інфікованої СНІДом крові або продуктів крові. Перший випадок СНІДу в Китаї був заражений при використанні імпортних препаратів крові, інфікованих вірусом СНІДу. Крім того, повідомлялося про передачу гепатитів В і С через переливання крові та її продуктів.

 

1. Основні віруси, що передаються продуктами крові, та їх характеристика

Існує багато типів вірусів, які передаються через кров і продукти крові, як показано в таблиці 1. Серед них ВІЛ, ВГВ і ВГС викликають занепокоєння у вітчизняних і закордонних медичних колах через високий рівень зараження та серйозну шкоду.

Оскільки кров і продукти крові можуть поширювати віруси, це серйозно вплинуло на їх застосування в профілактиці та лікуванні захворювань. Таким чином, у виробництві продуктів крові необхідно додати процеси інактивації та видалення вірусів, щоб забезпечити безпеку продуктів крові.

2. Основні методи інактивації та видалення вірусу

Для забезпечення безпеки продуктів крові, на додаток до відбору донорів крові, імунізації, де це можливо, і суворого тестування зібраної крові та інших заходів, інактивація та видалення вірусної обробки продуктів крові є важливою ланкою для забезпечення безпечність переливання крові. Нижче детально описано декілька поширених і ефективних методів дезактивації та видалення вірусів.

 

I. Методи інактивації вірусу

1. Метод Пастера

Теоретичною основою цього методу є те, що швидкість руйнування структури вірусу значно вища, ніж структури білка через підбір температури та часу дії. Результати майже 50 років клінічного використання та нещодавні експерименти на тваринах підтвердили, що альбумін у розчині після 60-градусної 10-годинної обробки нагріванням, тобто пастерівської дезінфекції, може не тільки інактивувати HBV, але також інактивувати HCV та ВІЛ, що робить альбумін найнадійнішим продукт крові у вірусній безпеці.

Нещодавно процес Пастера був поширений на виробництво IVIG, FVI, FIX, фібриногену та інших продуктів. Bridonnccu та ін. додали цей процес інактивації вірусу до низькотемпературного процесу виробництва етанолу IVIG, тобто метод Пастера було реалізовано в умовах відсутності стабілізатора, низької солі та кислотності, і титр вірусу знизився на 5 Log. Сіммондс та ін. перевірив вірус, що передається через трансфузію (TTV) концентрованих препаратів FVⅢ ​​і FIX, які клінічно використовуються у Великобританії, і виявив, що рівень виявлення TTV продуктів без інактивації вірусу Пастера становив від 50% до 75%, а позитивний рівень виявлення продуктів після пастерівської інактивації було 0.

Позитивний показник TTV становив 27% у 84 хворих на гемофілію у Сполученому Королівстві, які використовували продукти з неінактивованим фактором згортання крові, тоді як лише 1 із 19 пацієнтів, які використовували продукти з інактивованим фактором згортання крові, був позитивним, із позитивним рівнем виявлення 5%. Таким чином, процес інактивації вірусу дуже ефективний для підвищення безпеки продуктів крові.

 

2. Органічний розчинник у поєднанні з ПАР (метод S/D)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Велика кількість препаратів крові, інактивованих методом S/D, були доведені безпечними та надійними завдяки тривалому клінічному застосуванню, тому вони широко використовуються. Однак цей метод не має інактиваційної здатності проти парвовірусу В19, HEV та інших вірусів, не вкритих жировою оболонкою.

 

3. Метод інактивації сухим жаром

Інактивація сухим жаром означає, що ліофілізований препарат обробляють нагріванням і вірус гине сухим теплом. Зазвичай використовуються методи сухого тепла: 60 градусів ~80 градусів, 10~72 години метод нагрівання та 80 градусів, 72 години метод лікування. Ще на початку 1980-х років було корисно нагрівати ліофілізований концентрований препарат FVIII і протромбіновий комплекс при 60-80 градусах протягом 10-72 годин. Однак доведено, що цей метод не може повністю інактивувати HBV, HCV, HIV. Обробка сухим жаром при 80 градусах і 72 години була доведена як ефективна для інактивації HBV, HCV та ВІЛ. Також нещодавно надходили повідомлення про ліофілізовані препарати факторів згортання крові, оброблені при 100 градусах. Xu Jinbo та інші обробляли IgG при 100 градусах протягом 30 хвилин і інактивували вірус везикулярного стоматиту 8,2 Log. Деякі люди ліофілізують FVIII при 68 градусах протягом 72 годин у сухому стані, а потім нагрівають при 100 градусах протягом 0,5~1 години. Цей спосіб відносно економічний.

 

4. Фотохімічний метод

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Журнал клітин, зв’язаних з ВІЛ, і тромбоцитів залишалися хорошими після 7 днів функціонального збереження in vitro, що було схвалено FDA для клінічних випробувань.

Серед цих методів, метод дезінфекції Пастера та метод S/D схвалені FDA США та широко використовуються у світі. Метод інактивації сухим жаром в основному підходить для інактивації вірусів ліофілізованих препаратів. Фотохімічний метод має сильний інактиваційний ефект на віруси, вкриті ліпідами, і використовувався для інактивації вірусу цільної плазми в Європі, і має широкі перспективи для інактивації вірусу в компонентах клітин крові. Проте всі ці методи мають свої недоліки, наприклад пастерівська стерилізація не ідеальна для інактивації деяких термостійких вірусів; Метод S/D не міг ефективно інактивувати вірус без жирової оболонки. Фотохімічний метод значно порушив активність деяких білків плазми. Сучасне клінічне використання подальших досліджень показує, що жоден метод інактивації вірусу не може гарантувати, що продукти крові абсолютно не піддаються ризику передачі вірусів.

 

I. Процес видалення вірусів

У виробництві продуктів крові один процес інактивації не може інактивувати всі віруси; Крім того, сам вірус є гетерологічним білком, наприклад, введення з продуктом викличе побічні реакції; У той же час, через обмеження технічного рівня, все ще існують віруси, характеристики яких не знайдені або зрозумілі, тому існуючі методи інактивації вірусів не можуть гарантувати інактиваційний ефект цих вірусів. Таким чином, сама по собі інактивація не може гарантувати безпеку продукту, і її необхідно видалити з продукту. Тому технологія видалення вірусів привертає все більше уваги. Нижче коротко описано два поширені й ефективні процеси видалення вірусів.

1. Хроматографічна технологія

Хроматографічна технологія стосується використання різноманітних компонентів і різниці спорідненості стаціонарної фази або взаємодії для досягнення поділу різних компонентів. Будучи передовою технологією виробництва продуктів крові, хроматографія сама видаляє віруси, особливо афінна хроматографія та іонообмінна хроматографія. Для іонообмінної хроматографії елюювання має переваги перед проникненням у видаленні вірусу. У таблиці 2 наведено статистичні дані швидкості видалення ВГА за допомогою хроматографічної технології в процесі виробництва альбуміну компанією CSL в Австралії. Як видно з таблиці 2, іонообмінна хроматографія та гель-фільтрація більш ефективні для видалення ВГА із загальною швидкістю видалення 10,9 log.

Під час виробництва FVIII Baxter Healtheare проводить імуноафінну хроматографію з використанням гелів, оброблених антитілами до FVIII, які можуть видалити (4,2±0.1)Log та (5,3±0.9)Log з не - віруси з ліпідним покриттям, такі як PPV і HAV відповідно.

 

2. Наноплівкова фільтрація

Для деяких вірусів з малим діаметром поверхні, таких як HAV і парвовірус B19, наномембранна фільтрація є найефективнішим методом видалення. Він використовує різницю в розмірі білків і вірусів і адсорбцію вірусів мембраною фільтра для ізоляції вірусів. На сайті Sanquin Blood Supply Site у Нідерландах було проведено лабораторне дослідження щодо видалення вірусів шляхом додавання одноетапної двоступеневої наномембранної фільтрації Planova 15N до процесу виробництва протромбінового комплексу. Було виявлено, що швидкість видалення ВІЛ, HAV та інших вірусів була різною мірою збільшена після наномембранної фільтрації (див. таблицю 3).

Однак при застосуванні цього методу для промислового виробництва можуть виникнути наступні проблеми: по-перше, через високу в'язкість продукту та наявність білків великого діаметру розмір пор мембрани, обраної фільтром, не повинен бути занадто малим, таким чином обмежуючи видалення вірусів малого діаметра, таких як HCV; По-друге, стабільність контролю розміру пор мембрани в процесі виробництва фільтра вплине на видалення вірусу. По-третє, коли отвір мембрани, менший за діаметр вірусної частинки, блокується, швидкість потоку продукту буде зменшена, що вплине на вихід. Таким чином, вибір мембран, властивості та розмір пор яких відповідають потребам перероблених продуктів, є важливим фактором у тому, чи зможе наномембранна фільтрація видалити віруси.

 

3. Обговорення

Відповідно до передумови забезпечення якості джерела крові, процес інактивації та видалення вірусу є важливим і необхідним засобом забезпечення безпеки продуктів крові. Використання тільки одного інактивованого вірусного процесу не може абсолютно гарантувати безпеку продуктів крові. На основі технології інактивації вірусу було додано технологію видалення вірусу, таку як хроматографія та фільтрація наноплівок, швидкість видалення вірусу була значно збільшена, а ефект інактивації та видалення вірусу значно покращився. На даний момент Європа чітко запропонувала, щоб у процесі виробництва продуктів крові використовувалася принаймні одна інактивація та видалення вірусів для забезпечення безпеки продуктів крові.

У Китаї більшість виробників препаратів крові використовують лише один процес виробництва інактивованих вірусів, наприклад метод дезінфекції Пастера, метод S/D тощо, але не використовують процес видалення вірусів, що серйозно впливає на якість продуктів крові. Після вступу Китаю до СОТ процес виробництва та стандарти якості вітчизняних продуктів крові відповідатимуть світовим стандартам, інакше він не зможе гарантувати існуючу частку внутрішнього ринку, але також не зможе конкурувати з подібними продуктами в інших країнах у міжнародний ринок.

Тому китайські виробники продуктів крові повинні вдосконалити процес виробництва, посилити інактивацію та видалення вірусу, щоб повністю забезпечити якість і безпеку продукту. Таким чином, китайські виробники препаратів крові будуть використовувати хроматографію для очищення продуктів крові та видалення вірусів, щоб гарантувати безпеку продуктів крові.

 

Про Гідлінга

 

Guidling Technology — це національне високотехнологічне підприємство, яке спеціалізується на біофармацевтиці, культурі клітин, очищенні та концентрації біомедицини, діагностиці та промислових рідинах. Ми успішно розробили відцентрові фільтрувальні пристрої, ультрафільтраційні та мікрофільтраційні касети, вірусний фільтр, систему TFF, глибинний фільтр, порожнисте волокно тощо, які повністю відповідають сценаріям застосування біофармацевтичних препаратів, культур клітин тощо. Наші мембрани та мембранні фільтри широко використовуються в концентрації, екстракції та розділенні попередньої фільтрації, мікрофільтрації, ультрафільтрації та нанофільтрації. Наші численні лінійки продуктів, від невеликої одноразової лабораторної фільтрації до виробничих систем фільтрації, тестування на стерильність, ферментації, культури клітин тощо, відповідають потребам тестування та виробництва. Guidling Technology з нетерпінням чекає на співпрацю з вами!