Література Поділяється|Попрощайтеся зі складним очищенням? Новий метод TFF + поверхнево -активної речовини підвищує ефективність та зменшує витрати у виробництві вектора AAV

Генна терапія швидко розвивається, але її висока вартість залишається головним бар'єром, що запобігає більш широкому доступу до пацієнтів. Серед ключових драйверів цієї вартості - складний процес виробництва Adeno - асоційованих векторів вірусу (AAV). Дослідження, опубліковане в біотехнології та біоінженерії, розробило новий метод очищення, що поєднує фільтрацію тангенціального потоку (TFF) з ПАР, який обіцяє спростити процес очищення AAV та зменшити витрати. Давайте заглибимось у це дослідження під керівництвом команди з університету Токіо.

 

1. Дослідження: виклики та поточний стан очищення AAV

Вектори AAV стали "зірковими" інструментами доставки в генній терапії через їх високу безпеку, низьку імуногенність, здатність заражати як ділення, так і не - ділення клітин та здатність для довгого - експресії гена. Однак їх виробничий процес є складним, зокрема кроки очищення нижче за течією, які, як правило, передбачають багаторазові раунди центрифугування та хроматографії. Ці методи - це час - споживаючий, лейборист - інтенсивна, важка масштабна та дорога.

У лабораторних масштабах очищення часто покладається на хлорид цезій або градієнт щільності йодіксанолу ультрацентрифугування, що складно для масштабу промислового виробництва. Афційна хроматографія все частіше використовується, але умови, які вона вимагає, може погіршити вірусну інфекційність. Тому розробка простого, ефективного, ніжного та масштабованого методу очищення AAV є критичною.

Фільтрація тангенціального потоку (TFF) - це розмір - Техніка поділу на основі, що зазвичай використовується для концентрації та буфера - обміну біопродуктами. Однак звичайний TFF має обмежену здатність видаляти домішки, такі як білки клітин господаря (HCP) та ДНК під час очищення AAV, часто залишаючи білкові агрегати позаду.

 

2. Інноваційний підхід: TFF у поєднанні з ПАР для ефективного очищення

To overcome the limitations of traditional TFF, researchers Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, and colleagues at the University of Tokyo devised a clever strategy: using surfactants to inhibit aggregation and interaction of impurity proteins, allowing them to pass through the TFF ultrafiltration membrane (500 kDa molecular weight cutoff) while retaining AAV viral particles (~25 nm за розміром).

Вони протестували три види ПАР:

• Non - ionic:Октил глюкозид
• Аніон:Дезоксихолат натрію
• Zwitterionic:Шпилька

Дослідження виявило, що використання неефективного іонного поверхнево -активного речовини не - було неефективним. І аніонний дезоксихолат натрію, і цвіттеріонічні шапи значно посилили видалення залишкових білків, і вони орієнтувались на різні популяції білка. Зрештою, поєднання 0,5% дезоксихолату натрію з 1% Chaps дало чудові результати, майже повністю усунувши залишкові білки господаря. SDS - Аналіз сторінки показав лише три прозорі білкові смуги AAV Capsid (VP1/VP2/VP3).

 

Рисунок 1. Процес очищення TFF без ПАР;(a) SDS - Гель -електрофорез сторінки; (b) Мікроскопія електронної передачі (TEM)

 

Рисунок 1. Процес очищення TFF з ПАР;(a) SDS - Гель -електрофорез сторінки; (b) Мікроскопія електронів (TEM) (b) (TEM)

 

3. Результати досліджень: висока чистота, діяльність та безпека

1. Ефективне зняття домішок:Новий метод досяг 99,98% видалення HCP та 95% видалення ДНК, чистота, порівнянна з або перевищенням методу афінної хроматографії.
2. Поліпшена інфекційність:Експерименти in vitro показали, що вектори AAV1 очищені за допомогою цього методу, заражених клітинами HEK293 більш ефективно, ніж очищені за допомогою афінної хроматографії (24,9% проти 20,8%), що свідчить про краще збереження вірусної біоактивності.
3. Хороша безпека in vivo:Після місцевої ін'єкції очищених векторів AAV1 у скелетну м’яз миші не спостерігалося суттєвого запалення або пошкодження тканин через два тижні, демонструючи хорошу безпеку in vivo.
4. Широке застосування серотипу:Метод успішно очистив кілька серотипів -, включаючи супернатанти AAV1, AAV5, AAV8 та AAV9-FROM. Однак для AAV2, який в основному існує в клітинних лізатах з великим навантаженням, потрібна подальша оптимізація.

 

4. Короткий та світогляд

Це дослідження розробило простий, швидкий (1,5 години), ефективний та масштабований новий процес очищення AAV. Поєднуючи дезоксихолат натрію та Chaps, він успішно вирішив проблему залишкової агрегації білка під час очищення ТФФ.

Переваги методу включають:

• Уникнення суворих низьких умов рН, краще збереження вірусної активності
• Зменшення кроків хроматографії, спрощення робочого процесу та заощадження часу та витрат
• Легко масштабований, підходить для промислового великого -
• Забезпечення нової стратегії очищення інших біомакромолекул, таких як екзосоми, інші віруси та рекомбінантні антитіла

Поточні обмеження включають субоптимальне відновлення вірусу та неможливість відокремити порожні капсиди від повних вірусних частинок, що дозволяє припустити, що його найкраще використання може бути як першим - етапного захоплення в багаторічному робочому процесі очищення крок.

На закінчення, це дослідження пропонує привабливий новий варіант для виробництва вектора AAV вниз за течією та має потенціал значно знизити вартість препаратів генної терапії, полегшуючи їх широке застосування.