Коротке обговорення кількох унікальних методів холловолокна в інклюзійному очищенні тіла
Тільця включення (IB) — це нерозчинні білкові частинки високої щільності, загорнуті в мембрани, що утворюються, коли чужорідні гени експресуються в прокаріотичних клітинах, особливо в Escherichia coli. При спостереженні під мікроскопом IB є областю високого заломлення, яка явно відрізняється від інших компонентів цитоплазми.
Формування тілець включення відносно складне, пов’язане зі швидкістю виробництва білка в цитоплазмі, концентрація новоутворених пептидів висока, і не вистачає часу для згортання, щоб утворити аморфні білкові агрегати. Тільця включення в основному складаються з білків, понад 50% яких є клонованими продуктами. Первинна структура цих продуктів абсолютно правильна, але тривимірна конфігурація неправильна, тому біологічна активність відсутня. Розмір тільця включення становить 0.5-1 мкм, нерозчинний у воді, розчинний лише в денатурантах, таких як сечовина, гуанідин гідрохлорид тощо.
У E. coli тільця включення можуть знаходитись у двох місцях клітини: цитоплазмі та периферійній цитоплазмі. Розташування та характеристики тілець включення в клітині залежать від способу експресії білків.
Включення в цитоплазмі E. coli зазвичай мають діаметр від {{0}}.2 до 1,5 мкм, а різні білки мають різний діаметр, наприклад, розмір інтерферону становить 0,811 мкм, а розмір прорент становить 1,281 мкм. У деяких випадках діаметр деяких тілець включення більший, ніж діаметр E. coli, що надає E. coli виступ. Загалом клітина має лише одне тільце включення.
Інклюзійне очищення організму
Процес очищення тіла інклюзії загалом такий:
Дроблення клітин:
Загальна технологія подрібнення клітин: високошвидкісне подрібнення тканини, гомогенізація скляного гомогенізатора, ультразвукова обробка, повторний метод заморожування-розморожування, хімічна обробка (зазвичай з використанням обробки лізоцимом).
Включення миття тіла:
Тільця включення - це неактивні тверді частинки, утворені шляхом внутрішньоклітинної аглютинації білків, що експресуються бактеріями, які зазвичай існують в аморфній, нерозчинній формі. У тільці включення справжній цільовий білок становить лише близько 50%, а решта містить ліпіди, ліпополісахариди, нуклеїнові кислоти та гетеропротеїни, які зв’язані з тільцем включення та впливають на ренатурацію білка тільця включення. Тому промивання перед денатурацією є дуже необхідним етапом.
Крім того, промивання тілець включення допомагає збільшити вихід рекомбінантних білків при рефолдингу. Завдяки видаленню домішок можна зменшити перешкоди в процесі ренатурації, завдяки чому білок може бути більш ефективно згорнутий і правильно зібраний, тим самим покращуючи активність і функцію білка.
При пранні зазвичай використовується менше 1% нейтрального мийного засобу, такого як Tween, Triton, Urea та NP40 плюс EDTA та відновники 2-меркаптотреїтол (DTT), -меркаптоетанол, що повторюється багато разів, оскільки миюча здатність миючого засобу підвищується за допомогою підвищення іонної сили розчину, в промивку тілець включення можна додавати NaCl для підвищення іонної сили.
Тільця включення можна використовувати для видалення інших компонентів розчину для розпаду клітин центрифугуванням або фільтруванням, обидва з яких використовують різні фізичні властивості тілець включення.
Центрифугування:
Білки тільця включення набагато щільніші за той самий об’єм фрагментів клітини, тому тільце включення можна відокремити від решти клітини за допомогою центрифугування. Безперервне центрифугування є найбільш часто використовуваною операцією для отримання тілець включення в промисловому виробництві. Оскільки щільність клітинних фрагментів менша, ніж у тільця включення, швидкість седиментації менша, ніж у тільця включення. Безперервне суспендування та центрифугування можуть центрифугувати більшу частину тіла включення, тоді як фрагменти клітин поступово видаляються.
Фільтрація (фільтрація тангенціальним потоком): через різні молекулярні розміри тілець включення та розчинних білків можна використовувати метод фільтрації, що може зменшити експлуатаційні витрати та полегшити масштабування. Фільтрація тангенціального потоку (TFF) керується різницею трансмембранного тиску. Речовини та домішки, менші за розмір пор мембрани, проходять через мембрану, тоді як домішки, такі як клітини з більшими частинками, затримуються. Мембранний отвір, який зазвичай використовується для фільтраційного промивання, становить 0,1 мкм. Мікрофільтрація тангенціального потоку з порожнистих волокон може безпосередньо мати справу з високим вмістом твердих речовин рідкого матеріалу, меншою кількістю кроків, простою операцією, мембрану можна використовувати неодноразово шляхом очищення, зменшуючи інвестиції в обладнання та експлуатаційні витрати, відповідно до вимог модульного автоматизованого виробництва.
Нижче наведено приклад застосування для миття корпусу включення з використанням колон Guidling із порожнистим волокном.
Ми використовували 94 см2 0.1-0.45 мкм порожнисте волокно для концентрування 250 мл рідини (цільова молекулярна маса білка 17 кд). Протягом усього процесу промивання досліджували швидкість відновлення цільового білка та виснаження мембранного потоку.
0-71min – процес концентрації, 71-224min – процес промивання та фільтрації. Протягом усього процесу мікрофільтрації TMP поступово збільшувався, швидкість рідини на вході залишалася незмінною, а середній потік матеріалу становив 12LMH.
Результати показали, що цільовий білок був повністю захоплений, а швидкість відновлення цільового білка становила понад 90%. Направляючі стовпи з порожнистих волокон є стабільними та придатними для цього застосування.
Розчинення тіла включення:
Тільця включення зазвичай розчиняються за умови денатуруючого агента сечовини або гуанідину гідрохлориду, і розчинені білки тілець включення повністю денатуруються, тобто, за винятком збереження первинної структури та ковалентних зв’язків, усі водневі зв’язки та гідрофобні зв’язки руйнуються та гідрофобні. бічні ланцюги повністю оголені.
Сечовина і гуанідину гідрохлорид є денатурантами середньої сили, які легко видаляються діалізом і ультрафільтрацією. Загальна концентрація сечовини 8-10М, гуанідину гідрохлориду 6-8М. Розчинення сечовини має такі переваги, як неіонізація, нейтральність, низька вартість, видалення білка після ренатурації не спричинить великої кількості білкового осаду, а розчинені тільця включення можна очистити різними хроматографічними методами, тому воно широко використовується .
Рефолдинг білка тільця включення:
Розчинений рекомбінантний білок повинен бути правильно згорнутий, щоб утворити функціональний білок. Методи ренатурації включають розведення білкового розчину майже до нейтрального, видалення денатуранта, ренатурацію на колонці та гель-фільтраційну хроматографію. Серед них розведення розчину білка до майже нейтрального рівня та видалення денатуранта є поширеним класичним методом ренатурації, особливо метод ренатурації розведення має найвищий коефіцієнт використання.
Видалення денатурату:
Діаліз: перевага полягає в тому, що об’єм не збільшується, а швидкість видалення денатурату контролюється шляхом поступового зниження концентрації зовнішньої проникної рідини, але це займає тривалий час і легко утворює неактивні білкові агрегати, що не підходить для великомасштабна операція і не може бути застосована до масштабу виробництва.
Ультрафільтрація (TFF): легко контролювати швидкість діалізу, будь то дослідження та розробки, пілотні випробування чи виробництво, можна видалити денатуранти (зміна рідини + концентрація) за допомогою ультрафільтрації (TFF).
Очищення білків організму інклюзіями:
Методи очищення білка після ренатурації аналогічні методам очищення розчинного білка, а саме іонообмінна хроматографія, гель-фільтраційна хроматографія, афінна хроматографія, осадження сульфатом амонію тощо.
Тільця включення не мають біологічної активності, немає необхідності хвилюватися про втрату активності білка, а великі обсяги експресії не призведуть до загибелі клітин і максимізують стійкість до атаки протеази. Порожнисте волокно Jiuling можна гнучко застосовувати в подальшому процесі очищення тіл включення. На етапі миття корпусу включення, відмінна продуктивність, порівняно з відцентровим пранням, використання порожнистого волокна мікрофільтрації з дев’ятьма віковими технологіями для промивання тангенціальним потоком фільтрації може значно скоротити час процесу, а загальна швидкість відновлення може досягати понад 90%. Порожнисте волокно Jiuling також можна використовувати на етапі ренатурації білка тілець включення. Каламутність живильної рідини, відфільтрованої мікрофільтраційним порожнистим волокном, буде значно зменшена, а швидкість відновлення білка висока; Використання ультрафільтраційного порожнистого волокна може не тільки видалити денатуранти, але й скоротити час завантаження хроматографічного зразка, щоб заощадити час, зменшити об’єм наповнювача та знизити вартість виробництва. Швидкість відновлення порожнистих волокон мікрофільтрації/ультрафільтрації залежить від різних матеріалів, і загальна швидкість відновлення може досягати 90-95%.
Компанія Guidling Technology запрошує вас надіслати запит на набори тестів для відповідних оглядів.
Про Гідлінга
Guidling Technology — це національне високотехнологічне підприємство, яке спеціалізується на біофармацевтиці, культурі клітин, очищенні та концентрації біомедицини, діагностиці та промислових рідинах. Ми успішно розробили відцентрові фільтрувальні пристрої, ультрафільтраційні та мікрофільтраційні касети, вірусний фільтр, систему TFF, глибинний фільтр, порожнисте волокно тощо, які повністю відповідають сценаріям застосування біофармацевтичних препаратів, культур клітин тощо. Наші мембрани та мембранні фільтри широко використовуються в концентрації, екстракції та розділенні попередньої фільтрації, мікрофільтрації, ультрафільтрації та нанофільтрації. Наші численні лінійки продуктів, від невеликої одноразової лабораторної фільтрації до виробничих систем фільтрації, тестування на стерильність, ферментації, культури клітин тощо, відповідають потребам тестування та виробництва. Guidling Technology з нетерпінням чекає на співпрацю з вами!
