Запобіжні заходи щодо використання ультрафільтраційної трубки
(1) Виберіть відповідну ультрафільтраційну трубку. Як правило, молекулярна маса, яку необхідно зберегти, не повинна перевищувати 1/3 молекулярної маси цільового білка. Наприклад, якщо молекулярна маса цільового білка становить 35 кДа, можна вибрати ультрафільтраційну трубку з молекулярною масою 10 кДа. Якщо молекулярна маса цільового білка становить близько 10 kd, можна використовувати ультрафільтраційну трубку з молекулярною масою 3KD. Уважно прочитайте інструкцію та зверніть увагу на різну толерантність ультрафільтраційної мембрани до різних хімічних речовин.
(2) Щойно придбана ультрафільтрація суха. Перед використанням додайте надчисту воду, і вода повністю пройде через мембрану. Попередньо охолодіть його на крижаній бані або в холодильнику протягом кількох хвилин. Потім злийте воду і додайте білковий розчин. Додана кількість не повинна перевищувати білої лінії на верхній частині пробірки. Операція повинна бути легкою. Перед додаванням білкового розчину ультрафільтраційну трубку необхідно вставити на лід для попереднього охолодження.
(3) Баланс. І маса, і центр ваги повинні бути збалансовані. Зверніть увагу, що швидкість і прискорення не повинні бути занадто швидкими, інакше ультрафільтраційна мембрана буде безпосередньо пошкоджена. Почати відцентрову ультрафільтрацію (попереднє охолодження центрифуги до 4 градусів). Після того, як оберти різних центрифуг перетворюються в G, вони відрізняються. Відрегулюйте прискорення центрифуги на найнижчу передачу, щоб зменшити тиск на мембрану. Зауважте, що перед тим, як покинути центрифугу, ви повинні почекати, поки центрифуга не досягне цільової швидкості, інакше, якщо виникне проблема з центрифугою, ви не зможете впоратися з нею з першого разу. Напрямок мембрани та обертового вала регулюють відповідно до інструкцій (у випадку центрифуги, що обертається на кут, мембрана перпендикулярна валу). При практичному використанні швидкість зазвичай нижча, ніж в інструкції, що може продовжити термін служби відцентрової труби.
(4) Коли він концентрується до 1 мл, що залишився, візьміть 50 мкл буферного розчину і додайте 10 мкл, щоб протікати, щоб побачити, чи стане він синім, щоб судити, чи пропускає протеїн з ультрафільтраційної трубки. Якщо пробірка протікає, налийте верхній шар і пропустіть через нову пробірку і почніть ультрафільтрацію. Щоб точно визначити, чи не протікає пробірка, центрифугуйте з 5 мг БСА протягом 10 хвилин, потім пропустіть, пропустіть протеїновий клей або Бредфорд для грубого вимірювання та продовжуйте додавати розчин білка, що залишився для концентрації (працюйте на льоду, щоб запобігти потраплянню білка). нагрівають), доки не додадуть усі концентровані розчини. Зверніть увагу на те, чи відбувається осад білка під час центрифугування, що призводить до закупорки труби. Якщо випадає опад, визначте конкретну причину випадання осаду, чи є концентрація білка занадто високою, чи буфер є невідповідним; Перше можна вирішити шляхом одночасної ультрафільтрації кількома ультрафільтраційними трубками для зниження концентрації. Останнє полягає у зміні різних буферних розчинів до тих пір, поки білок не випаде в осад.
(5) Попередні кроки використовуються для концентрації білка. Якщо ви бажаєте змінити буфер, коли загальний розчин білка буде сконцентрований приблизно до 1 мл, обережно додайте новий буфер (ультрафільтрація через ультрафільтраційну мембрану 0.22 мкм), а потім концентруйте приблизно до 1 мл протягом трьох разів поспіль. Кінцевий об’єм останньої концентрації залежить від необхідної концентрації білка, яка зазвичай не перевищує 500 мкл, або може бути сконцентрована до менше 200 мкл. Відповідно до об’ємної концентрації щонайменше 10 разів кожен раз, вона може досягати більше 1000 разів тричі, що в основному може досягти мети зміни буфера.
