Застосування ультрафільтрації в екстракції природного колагену

Колаген, як природний білковий ресурс, має хорошу біосумісність, низьку антигенність, здатність до біодеградації та гемостазу, його щільну спіральну структуру та власні характеристики, що створює передумови для його індустріалізації. Колаген та його побічні продукти використовуються не лише як пакувальні матеріали, косметика та продукти охорони здоров’я, але також як харчові добавки для покращення м’ясного продукту, і він відіграє важливу роль, особливо в медичній галузі.

 

Що таке колаген?

 

Колаген є біологічною макромолекулою, основним компонентом сполучної тканини тварин, а також найбільш поширеним і широко поширеним функціональним білком у ссавців, що становить від 25% до 30% від загального білка, а в деяких організмах навіть до 80% і більше. Він відіграє роль сполучної тканини в клітинах тварин.

Встановлено, що в організмі дорослої людини міститься близько 3 кг колагену, який міститься в основному в людській шкірі, кістках, очах, зубах, сухожиллях, внутрішніх органах (включаючи серце, шлунок, кишечник, кровоносні судини) та інших частинах людського тіла. функція полягає в підтримці морфології та структури шкіри, тканин і органів, а також це важлива сировина для відновлення різних тканин після травм.

 

Існує багато типів білка колагену, і поширеними типами є тип I, тип II, тип III, тип V і XI. Завдяки хорошій біосумісності, біорозкладаності та біоактивності колаген широко використовується в харчовій промисловості, медицині, тканинній інженерії, косметиці та інших галузях.

Як добути натуральний колаген

Тваринні тканини худоби та птиці є основним способом отримання людиною природного колагену та його колагенових пептидів. Однак через пов’язані з цим захворювання тварин і певні релігійні вірування люди використовують колаген і його продукти, отримані від наземних ссавців, обмежено, і розвиток поступово повертається до морських організмів. Європейське агентство з безпеки харчових продуктів (EFSA) підтвердило, що навіть колаген, отриманий із кісток тварин, не має потенціалу для зараження коров’ячим сказом та іншими пов’язаними захворюваннями. Через відмінності в амінокислотному складі та ступені зшивання водні тварини, особливо колаген, багатий відходами їх переробки, такими як шкіра, кістки та луска, мають багато переваг, яких немає у колагену худоби. Крім того, колаген, отриманий з морських тварин, очевидно перевершує колаген з наземних тварин у деяких аспектах, таких як низька антигенність і гіпоалергенність. Таким чином, водний колаген може поступово замінити колаген наземних тварин. Як приклад було взято процес вилучення колагену з луски білого амура.

 

Екстракція колагену з луски білого амура методом ультрафільтрації

1. Матеріали та методи

1.1 Дослідний зразок

Неочищений водний екстракт колагену.

1.2 Методи випробувань

1.2.1 Процес ультрафільтрації

 

1.2.2 Визначення процесу попередньої фільтрації

У цьому тесті метод вакуумної фільтрації та метод мікрофільтрації порівнюються та аналізуються, щоб визначити найкращий процес попередньої фільтрації. Конкретні методи випробування такі:

① Неочищений водний екстракт колагену був відфільтрований шляхом вакуумного відкачування фільтрувального паперу для видалення зважених часток і домішок у водному екстракті.

② Неочищений водний екстракт колагену фільтрували за допомогою мікрофільтраційної мембрани 0.2 мкм для видалення нерозчинних речовин і домішок у водному екстракті.

 

1.2.3 Вибір розміру пор ультрафільтраційної мембрани

Розмір пор ультрафільтраційної мембрани становив 100 кДа.

 

1.2.4 Однофакторний експеримент процесу очищення ультрафільтрацією

Технологія ультрафільтрації була використана для очищення неочищеного водного екстракту колагену, а також досліджено однофакторні експерименти щодо впливу робочого тиску, робочої температури та значення pH на утримання колагену. Після того, як обладнання для ультрафільтрації було запущено протягом певного періоду часу та стабілізовано, було вивчено вплив різних факторів на утримання колагену.

 

1.2.5 Формула розрахунку

 

2. Результати та аналіз

2.1 Результати аналізу процесу попередньої фільтрації

Результати порівняння двох методів фільтрації вакуумної екстракції та мікрофільтрації наведені в наступній таблиці.

 

З таблиці видно, що як метод вакуумної фільтрації, так і метод мікрофільтрації можуть видалити домішки та нерозчинні тверді речовини в розчині, але метод мікрофільтрації має кращий захисний ефект на білки, тобто втрата неочевидна, а метод вакуумної фільтрації є легко спричинити втрату білків. Крім того, метод вакуумної фільтрації з’являється помутніння після того, як фільтрат поміщається на певний період часу, і мікрофільтрат залишається чистим і прозорим, тому мікрофільтрація вибирається як процес попередньої обробки ультрафільтрації.

 

2.2 Однофакторний тест процесу ультрафільтрації

2.2.1 Вплив тиску ультрафільтрації на швидкість утримання

За умови температури 40 градуси та рН=9.0, вплив різних тисків ультрафільтрації (0.07MPa, {{9} }.09 МПа, 0,11 МПа, 0,13 МПа та 0,15 МПа) на утримування білка було вивчено. Результати показані на малюнку нижче.

Як видно з малюнка вище, зі збільшенням робочого тиску швидкість утримання білка поступово зменшується. Коли робочий тиск становить {{0}}.07 МПа, рівень утримання білка становить 96,53%, а коли робочий тиск становить 0,15 МПа, рівень утримання білка становить 84,38%. Це пояснюється тим, що ефект розділення ультрафільтрації на речовини здійснюється за рахунок різниці тисків. У діапазоні низького робочого тиску малі молекули можуть швидко проходити через мембрану, тоді як великі молекули можуть бути захоплені ультрафільтраційною мембраною та накопичуватися на поверхні мембрани. У цей час поверхня мембрани та водний екстракт утворюють різницю концентрацій, що призводить до поляризаційного опору концентрації. У цей час тиск відносно низький і не може сильно вплинути на швидкість утримання. Однак із збільшенням тиску концентраційний поляризаційний опір поступово зростає, і різниця концентрацій між поверхнею мембрани та водним екстрактом досягає рівноваги. Коли тиск перевищує цю рівновагу, на поверхні мембрани може утворюватися шар гелю (що узгоджується з теорією про те, що під час ультрафільтрації утворюються концентраційна поляризація та шар конденсації), і тиск продовжує зростати, товщина шару гелю збільшується. , і кількість білка, що залишається на поверхні мембрани, також збільшується. Це призводить до нижчого рівня утримання. Для забезпечення ефекту розділення мембрани оптимальним параметром робочого тиску є 0,07 МПа.

 

2.2.2 Вплив температури на збереження білка

За умов тиску {{0}}.11 МПа та pH=9.0 вплив різних температур, а саме 25 градусів, 30 градусів, 35 градусів, 40 градусів і 45 градусів, на білок утримання були вивчені. Результати показані на малюнку нижче.

Як видно з малюнка вище, швидкість утримування ультрафільтраційної мембрани поступово зростає з підвищенням температури та досягає максимуму при 45 градусах, зі швидкістю утримання 97,01%. Це пояснюється тим, що в’язкість колагену тісно пов’язана з температурою. Коли температура низька, в'язкість колагену більша, і накопичення колагену на поверхні мембрани легко утворює опір, що призводить до низької швидкості утримання. При підвищенні температури в'язкість колагену зменшується, взаємодія між молекулами колагену послаблюється, і швидкість масообміну збільшується, явище концентраційної поляризації послаблюється, а швидкість утримування збільшується. Іншою причиною збільшення швидкості утримання є те, що температура підвищується, розчинність колагену також відповідно збільшується, а явище колагену, що блокує мембрану, зменшується, тому оптимальна температура ультрафільтрації становить 45 градусів.

 

2.2.3 Вплив значення pH на затримку білка

За умов тиску {{0}}.11MPa та температури 40 градусів, вплив різних умов рН, а саме pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, рН=8.0, рН=9.0 і рН=10.0, на швидкість утримування вивчали. Результати показані на малюнку нижче.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, швидкість утримання поступово зростає зі збільшенням значення pH. Це пов’язано з тим, що ультрафільтраційна мембрана є поліефірною кленовою мембраною з негативним зарядом, а колаген негативно заряджається в лужних умовах. Негативно заряджені молекули колагену утворюють взаємовиключний стан з ультрафільтраційною мембраною з однаковим зарядом, тому молекулам колагену нелегко утримуватися на поверхні мембрани та блокувати мембрану. Тому оптимальне значення pH ультрафільтрації становить 8-10.

 

2.3 Оптимізація процесу ультрафільтрації та перевірка результатів

Відповідно до аналізу програмного забезпечення Design-Expert8.05 оптимальні параметри процесу: робочий тиск 0.14 МПа, робоча температура 40.98 градусів, pH розчину{{7 }}.43, а рівень утримання становить 92,551%. Враховуючи працездатність фактичних параметрів, умови ультрафільтрації були вибрані як робочий тиск 0,14 МПа, робоча температура 40 градусів і значення pH 9,50 розчину матеріалу, а перевірка випробувань була розпочата після запуску та стабілізації системи ультрафільтрації. Результат коефіцієнта утримання склав (92,61±0,1) % (n=3). Прогнозовані значення рівняння в основному подібні до виміряних значень, що показує, що прогнозовані результати параметрів умов узгоджуються з фактичними результатами умов.

 

2.4 Результати електрофоретичного аналізу

Очищений колаген аналізували за допомогою електрофорезу SDS-PAGE, і результати були показані на наступному малюнку.

 

Як видно на малюнку вище, доріжка 1 — це очищений колаген цього тесту, а доріжка 2 — стандартний зразок колагену сухожилля литки. З електрофорезу SDS-PAGE можна побачити, що колаген у цьому дослідженні можна ідентифікувати як колаген, але межі між пептидним ланцюгом a1 і пептидним ланцюгом a2, здається, нечіткі. З електрофоретичної карти видно, що інших білкових домішок немає, тому можна зробити висновок, що очищений колаген має високу чистоту.

Про Гідлінга

 

Guidling Technology — це національне високотехнологічне підприємство, яке спеціалізується на біофармацевтиці, культурі клітин, очищенні та концентрації біомедицини, діагностиці та промислових рідинах. Ми успішно розробили відцентрові фільтрувальні пристрої, ультрафільтраційні та мікрофільтраційні касети, вірусний фільтр, систему TFF, глибинний фільтр, порожнисте волокно тощо, які повністю відповідають сценаріям застосування біофармацевтичних препаратів, культур клітин тощо. Наші мембрани та мембранні фільтри широко використовуються в концентрації, екстракції та розділенні попередньої фільтрації, мікрофільтрації, ультрафільтрації та нанофільтрації. Наші численні лінійки продуктів, від невеликої одноразової лабораторної фільтрації до виробничих систем фільтрації, тестування на стерильність, ферментації, культури клітин тощо, відповідають потребам тестування та виробництва. Guidling Technology з нетерпінням чекає на співпрацю!