Як вибрати відповідну ультрафільтраційну трубку
Ультрафільтраційні пробірки, які зазвичай використовуються для концентрації білка та заміни буфера, часто використовуються в ультрафільтраційних пробірках. Існують інші моделі, які мають різні розміри об’єму та ультрафільтраційні трубки, залежно від молекулярної маси цільового білка, об’єму до концентрації та цільового об’єму концентрації. Багаторазове використання.
1. Виберіть відповідну ультрафільтраційну трубку, в основному враховуючи MWCO та об’єм концентрації. Як правило, молекулярна маса не повинна перевищувати 1/3 молекулярної маси цільового білка. Якщо молекулярна маса цільового білка становить близько 10 кД, можна використовувати ультрафільтраційну трубку із збереженою молекулярною масою 3 кД.
2. Щойно придбана ультрафільтрація суха. Перед використанням додайте мілку води. Вода повністю проходить через мембрану і попередньо охолоджується на крижаній бані або в холодильнику протягом кількох хвилин. Потім злийте воду, щоб додати білковий розчин. Кількість білкового розчину не повинна перевищувати білої лінії на верхній частині пробірки. Простота експлуатації. Перед додаванням білкового розчину ультрафільтраційну трубку необхідно вставити в лід для попереднього охолодження.
3. Баланс. Маса і центр ваги повинні бути збалансовані. Зверніть увагу, що швидкість і прискорення не повинні бути занадто швидкими, інакше ультрафільтраційна мембрана буде безпосередньо пошкоджена. Почніть відцентрову ультрафільтрацію (попереднє охолодження центрифуги до 4 градусів). Напрямок діафрагми та обертового вала можна регулювати згідно з інструкцією (у разі кутової центрифуги діафрагма перпендикулярна валу). Під час фактичного використання загальна швидкість нижча, ніж зазначена в інструкції, що може продовжити термін служби відцентрової труби.
4. при концентрації до 1 мл, що залишився, [візьміть 50 мкл побутового розчину Бредфорда, додайте 10 мкл рідини, щоб побачити, чи він стане синім, і визначте, чи пропускає білок через ультрафільтраційну трубку. Якщо пробірка протікає, залийте її у верхній шар, а потім поверніть назад у нову пробірку, щоб почати ультрафільтрацію. Щоб точно визначити, чи протікає пробірка, 5 мг 10 хв центрифугуйте 10 хв, потім пропустіть її, запустіть протеїновий гель або Бредфорд] [грубе вимірювання]. Продовжуйте додавати білковий розчин, що залишився, до концентрації (працюйте на льоду, щоб запобігти нагріванню білка), доки не будуть додані всі концентровані розчини. Під час центрифугування зверніть увагу на те, чи відбувається випадання білка в осад і не викликає закупорку трубки. Якщо випадає опади, будь ласка, визначте конкретну причину опадів, чи є концентрація білка занадто високою, чи буфер є невідповідним; Перший можна вирішити, використовуючи кілька ультрафільтраційних трубок одночасно для зниження концентрації, тоді як другий може змінювати різні буфери, поки білок не випаде в осад.
5. Попередні кроки використовуються для концентрації білка. Якщо буфер потрібно замінити, коли загальний розчин білка зконцентрується приблизно до 1 мл, обережно додайте новий буфер (ультрафільтрація через ультрафільтраційну мембрану 0.22 мкм), а потім безперервно концентруйте приблизно до 1 мл протягом трьох разів, щоб що кінцева концентрація залежить від необхідної концентрації білка, яка зазвичай становить не більше 500 мкл або менше 200 мкл. Відповідно до об’ємної концентрації щонайменше в 10 разів кожен раз, це більш ніж у 1000 разів більше, ніж у три рази, що в основному може досягти мети зміни буфера.
6. Видаліть кінцевий білковий концентрат. Діяти на льоду. Використовуючи жовтий наконечник піпетки (200 мкл), обережно вставте наконечник піпетки вздовж краю, потім обережно подуйте та перемішайте білковий розчин. Будьте обережні, щоб не торкатися ультрафільтраційної мембрани. Кожного разу всмоктуйте концентрований розчин до 200 мкл, поки він повністю не всмоктується. Витягувати останній концентрований розчин на дно пробірки не потрібно, інакше це надто важко і може пошкодитися ультрафільтраційна мембрана. Нарешті, вода Milliq додається до ультрафільтраційної трубки, не проходячи через ультрафільтраційну мембрану, щоб запобігти втраті води та висиханню мембрани.
7. Нижче наведено кроки для обробки ультрафільтраційної трубки та повторного використання ультрафільтраційної трубки.
8. Налийте воду в ультрафільтраційну трубку і кілька разів обережно промийте її водою. [якщо на дні пробірки є очевидний осад білка, можна спочатку додати воду, а потім здути її піпеткою. Будьте обережні, щоб не торкатися мембрани. Осад звисає, а потім тікає. Ви не можете промити його водою з-під крана. Після додавання 0.2 м розчину NaOH поставте його при кімнатній температурі на 20 хвилин і протягом цього періоду збалансуйте ультрафільтраційну трубку. Центрифугувати ще 10 хвилин. Вилийте розчин NaOH, що залишився, і занурте бавовняну серцевину в склянку (1 або 2 л) з водою Milliq, поміщену на кілька годин, а потім замініть новою водою, поставлену на кілька годин для постійного розбавлення концентрації NaOH. Промийте пробірку об’ємом 50 мл і накрийте її водопровідною водою, а внутрішню стінку промийте водою з міллю.
9. Вийміть серцевину зануреної пробірки, додайте її до повної води, а потім наповніть пробірку об’ємом 50 мл водою. Повільно помістіть серцевину пробірки в 50 мл.
Центрифужну пробірку злийте і розділіть воду, потім накрийте кришкою і зберігайте при 4 градусах до наступного використання. Загалом, згідно з наведеними вище кроками та застереженнями, кожна трубка не зламається протягом трьох-чотирьох років.
