Посібник з високоякісного рекомбінантного очищення білка: Оптимізація процесу вниз за течією та програми фільтрації дотичного потоку

Recombinant proteins are widely used in biopharmaceuticals, vaccine development, and in vitro diagnostics. Their purification quality directly impacts the activity, stability, and safety of the final product. Downstream purification is the critical step for obtaining high-purity, high-yield proteins. Tangential Flow Filtration (TFF) , due to its efficiency and scalability, все частіше стає життєво важливим інструментом у робочих процесах очищення білка .

Ця стаття систематично окреслює ключові етапи очищення рекомбінантних білків, з акцентом на стратегії застосування технології TFF . вона спрямована на допомогу дослідженню та промисловим користувачам у оптимізації процесів очищення та підвищення якості білка .}}

 

I . Основні кроки при очищенні рекомбінантних білків нижче

1. Урожай та лізис

Центрифугування/глибина фільтрація: видаляє клітинні сміття та домішки; підходить для бактеріальних, дріжджів тощо ., систем виразів .

Співзасновність/гомогенізація високого тиску: розбиває клітини для вивільнення цільових білків; Умови потребують оптимізації для запобігання денатурації білка .

Ферментативний лізис: e . g ., лікування лісозимами для бактерій; Ніжні умови, але більша вартість .

2. Первинне очищення: Захоплення цільового білка

Хроматографія спорідненості (e . g ., His-Tag, білок A/G): Висока специфічність; досягає високої чистоти в одному кроці .

Іонна обмінна хроматографія (IEX): відокремлює білки на основі відмінностей заряду; підходить для очищення раннього до середнього рівня етапу .

Хроматографія гідрофобної взаємодії (HIC): використовує відмінності в гідрофобності поверхні білка; Ефективні для певних складних білків .

3. Поліровування: Підвищення чистоти

Хроматографія розміру-ексклюзії (SEC): видаляє агрегати та домішки з невеликими молекулами; Обмежена ємність завантаження .

Мультимодальна хроматографія (e . g ., capto adhere): поєднує кілька режимів взаємодії для більшої роздільної здатності .

4. Концентрація та обмін буферами

Ультрафільтраційні відцентрові пристрої: підходить для невеликих зразків; схильний до втрати білка .

Фільтрація тангенціального потоку (TFF): Ефективна, масштабована, ідеальна для промислового виробництва (детально описана пізніше) .

5. Стерилізація та зберігання

0 . 22 мкм фільтрація: Видаляє мікроорганізми, що забезпечують стерильність.

Додавання стабілізаторів (e . g ., гліцерин, bsa): запобігає деградації білка .

 

II . ключові програми дотичної фільтрації потоку (TFF) у очищенні нижче за течією

Tangential Flow Filtration (TFF) reduces membrane fouling via tangential flow, making it suitable for concentrating, desalting, and buffer exchanging large-volume samples. It offers significant advantages over dead-end filtration (e.g., ultrafiltration centrifugation).

 

1. Переваги технології TFF

✔ Високе відновлення: мінімізує втрати адсорбції білка, особливо важливо для дорогоцінних зразків .

✔ Лінійна масштабованість: Застосовується з лабораторної шкали (10 мл) до шкалу виробництва (1000L+) .

✔ Гнучкість процесу: одна система може виконувати концентрацію, діаліз (буферний обмін) та діафільтрація .}}

 

2. TFF Касета/Посібник

Мембранний матеріал	Характеристики	Сценарії застосування
Поліетсульфон (PES)	Низьке зв'язування білка, хімічно стійкий (стійкий до рН), високий потік	Суворі буферні умови
Регенерована целюлоза (RC)	Низьке зв'язування білка, високий потік, звичайний білок	Рутинне очищення білка/антитіла

Керівні принципи відбору молекулярної маси (MWCO):

1/3 до 1/5 молекулярної маси цільового білка (E . g ., використовуйте мембрану 10 кДа для білка 30 кДа) .

Щоб видалити агрегати, виберіть менший розмір пор (e . g ., використовуйте мембрану 50 кДа для білка 100 кДа) .

 

3. Оптимізація критичних робочих параметрів TFF

Трансмембранний тиск (TMP): зазвичай 3–15 фунт / кв.дюйм; Надмірно високий TMP сприяє забрудненню .

Тангенціальна витрата: підтримує турбулентність для мінімізації поляризації концентрації; Зазвичай 4–8 л/хв · м² .

Методи вдосконалення врожаю:

Використовуйте 2–5 обсягів буфера під час діафільтрації для повного обміну .

Виконайте зворотний розмивання в кінці, щоб відновити залишковий білок .

 

4. Типове тематичне дослідження: Очищення моноклонального антитіла (MAB)

Уточнена клітинна культура рідина → хроматографія спорідненості білка А → інактивація вірусної інактива

 

Роль TFF:

Швидко концентрує розведений білок A eluate до цільової концентрації .

Обмінює буфер на PBS або буфер рецептури (e . g ., буфер гістидину) .

 

III . Загальні проблеми та рішення

❌ Задача 1: Низьке відновлення білка

Можливі причини: адсорбція мембрани; Опади внаслідок надмірної концентрації .

Рішення: перехід на мембрану з низькою зв'язуючою; Додати ПАР (E . g ., 0 . 01% Tween 20).

❌ Проблема 2: швидкий занепад потоку

Можливі причини: мембранне забруднення або поляризація концентрації .

Рішення: оптимізуйте тангенціальну швидкість потоку; впровадити регулярне зворотне розгортання; Перейдіть на більш відкриту структуру мембрани (E . g ., 30 кДа замість 10 кДа) .

❌ Проблема 3: агрегація білка

Можливі причини: надмірна сила зсуву; непридатний буфер .

Рішення: зменшити швидкість насоса; Використовуйте більш ніжні буфери (e . g ., що містить сахарозу або naCl) .

 

Iv . підсумок

Obtaining high-quality recombinant proteins relies on optimizing downstream purification processes. Tangential Flow Filtration (TFF) technology, with its efficiency and scalability, has become a critical tool for concentration and buffer exchange. By rationally selecting membrane cassettes, optimizing operational parameters, and integrating chromatography techniques, both protein purity and yield can be significantly Розширений, відповідаючи вимогам як дослідницьких, так і промислових виробничих масштабів .